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        細胞傳代步驟

        發布時間:2020/8/27 15:31:25      閱讀次數:2246

         

         細胞傳代步驟,細胞有貼壁和懸浮細胞,還有懸貼混合的,一般貼壁和懸浮分開處理,具體傳代步驟如下:

        細胞傳代如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的完全培養液收集至離心管中,留5ml完全培養基,放入37℃、5%CO2孵箱培養;如果細胞密度80%,即可進行傳代培養,傳代具體步驟如下細胞傳代:

         細胞傳代步驟A1、對于懸浮細胞,傳代可參考以下方法:

        方法一:收集細胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄上清液,補加1-2ml培養液后吹勻,將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或瓶中。

        方法:可選擇半數換液方式,棄半數培養基后,將剩余細胞懸起,將細胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養基新皿中或者瓶中。

        A2、懸浮細胞凍存:

        1、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時,將T25 培養瓶中的懸液收集至離心管中1000rpm離心5min;

        2、棄上清,沉淀細胞加入1ml/支的雅吉生物無血清凍存液(C7001),混勻后加入凍存管中。(如:凍一支,加入 1ml 無血清凍存液即可)

        3、將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可;如后期要將細胞轉入液氮罐中,需在-80℃冰箱存

        24 小時以上。

         細胞傳代步驟B1、對于貼壁細胞,傳代可參考如下方法:

        1. 棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

        2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加5ml以上完全培養基終止消化。

        3.輕輕吹打細胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉移至15ml離心管中,1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加1-2mL完全培養重懸。

        4. 將細胞懸液按1:2的比例進行分瓶傳代(兩個T25瓶),補充新的完全培養基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

        B2、貼壁細胞凍存:

        1、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時,棄T25培養瓶中的培養液,用PBS清洗細胞一次;

        2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養液終止消化,再輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min;

        3、 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號:C7001),混勻后加入凍存管中。

         細胞傳代步驟

        細胞復蘇:

        1、從液氮中取出細胞凍存管(注意佩戴防護面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;

        2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;

        3、棄上清,沉淀用5ml完全培養基重懸,接種T25培養瓶,37℃,5%CO2細胞培養箱中培養;

        第二天,換用新鮮完全培養基繼續培養。

         細胞傳代步驟常見問題及解決方案:
        1.培養瓶有破裂,培養液有漏液:細胞極大可能會污染,所以我們會及時安排幫老師解決。
        2.細胞漂。号囵B瓶不開封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養箱。1-2 小時后觀察,如細胞大部分又貼回瓶底,表明細胞活力正常,剩余漂浮的細胞可以去掉,留 8-10ml 培養液培養觀察,細胞生長至匯合度 85-95%,進行消化傳代;如細胞還是不貼壁,將細胞離心收集轉到新培養瓶,原培養瓶加部分培養液繼續培養,中間注意觀察,我 們的技術人員會一直跟蹤指導,直到問題解決。


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